Terapötik peptit tilapia piscidin 4' ün (TP4) pichia pastoris ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi ve HT-29 kolorektal kanser hücreleri üzerine etkisinin araştırılması

Tilapia piscidin 4 (TP4), Nil Tilapyası (Orechromis niloticus) balıklarının bağışıklık sisteminde yer alan ve yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip katyonik bir peptittir. Antimikrobiyal özelliğinin yanı sıra yara iyileştirici ve antikanser özellikleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik özelliklere sahiptir. Tez çalışması kapsamında, TP4 peptitinin kodon optimizasyonlu dizisi, Pichia pastoris KM71H ekspresyon sisteminde güçlü ve indüklenebilir AOX1 promotörünü içeren pPICZA vektörü kullanılarak eksprese edilmiştir. Rekombinant TP4 peptiti, Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve antibakteriyel aktivitesi MİK ve MBK yöntemleri ile doğrulanmıştır. TP4, HT-29 kolon kanseri ve HGF-1 sağlıklı dişeti fibroblast hücrelerine uygulanarak hücrelerdeki sitotoksik etkiler MTT, TAS-TOS, MDA yöntemleri ile apoptozda yer alan genler (BAX, BCL-2, CASP3) ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri ise RT-qPZR ve ELISA yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. Bu tez kapsamında rekombinant TP4'ün insan HT-29 hücre hattında güçlü antikanser aktiviteye sahip olduğu ilk kez gösterilmiştir.

Tilapia piscidin 4 (TP4), a cationic peptide with high antimicrobial activity, is part of the immune system of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). In addition to its antimicrobial properties, it has various biological significances, including wound healing and anticancer properties. In the scope of this thesis, the codon-optimized sequence of the TP4 peptide was expressed in the Pichia pastoris KM71H expression system under the pPICZαA expression vector, which includes the strong and inducible AOX1 promoter. Recombinant TP4 peptide was purified by Ni-NTA affinity chromatography and its antibacterial activity was confirmed by MIC and MBC methods. TP4 was applied to HT-29 colon cancer and HGF-1 healthy gingival fibroblast cells and cytotoxic effects on the cells were investigated by MTT, TAS-TOS, MDA methods and the expression levels of genes (BAX, BCL-2, CASP3) and proteins involved in apoptosis were investigated by RT-qPCR and ELISA methods. In this thesis, it was shown for the first time that recombinant TP4 has strong anticancer activity in human HT-29 cell line.