Sürdürülebilir Kalkınma Amaçları

• 1
• 1

Araştırmacılar(2)

• Erden-Karaoglan, Fidan
• Şahin, Özlem

• ArticleAçık Erişim2025/r/ebyu/19570
  Melocan'ın (smılax excelsa l.) farklı kısımları için süperkritik karbon dioksit ekstraksiyon koşulları

  Bostancı, Esra; Vural, Halil; Şahin, Özlem

  Özellikle Türkiye’nin Karadeniz bölgesinde hem geleneksel mutfak kültüründe hem de geleneksel tıpta oldukça önemli yere sahip olan melocan, ormanlık arazilerin çalılık bölgelerinde kendiliğinden yetişen tırmanıcı, dikenli ve çok yıllık bir bitkidir. Bu çalışmada çevre dostu bir yöntem olan süperkritik karbon dioksit (Sc-CO2) ekstraksiyon yöntemi ile melocan bitkisinin farklı kısımları (filiz, meyve ve yaprak); iki farklı basınç (250 ve 350 bar), sıcaklık (30 ve 50 °C), süre (60 ve 90 dakika (dk)) ve iki farklı etanol konsantrasyonunda (%10 ve %20) ekstrakte edilmiştir. 350 bar basınç ve 50 °C'de, %20 etanol ile 90 dk Sc-CO2 ekstraksiyonuna tabii tutulan melocan yaprağının; 2265.1 mg gallik asit eşdeğeri (GAE)/kg kuru ağırlık olarak toplam fenolik madde (TFM) ve 2876.7 mg troloks eşdeğeri (TE)/kg kuru ağırlık olarak toplam antioksidan kapasite (TAK) açısından en iyi sonucu verdiği belirlenmiştir.

  • 
  İncele
• ArticleAçık Erişim2022/r/ebyu/20525
  Bakteriyel Kaynaklı Lipaz Geninin Pichia pastoris’te Klonlanması, Ekspresyonu ve Rekombinant Enzimin Saflaştırılması

  Karaoğlan, Mert; Karaoğlan, Fidan Erden

  Gıda endüstrisinde enzimler her türlü işleme ve üretim proseslerinde uygulama alanı bulan biyolojik katalizörlerdir. Süt işlemeden meyve suyu üretimine, et işlemeden ekmek üretimine kadar gıda sanayinin çeşitli alanlarında yaygın olarak ihtiyaç duyulan enzimlerden biri lipazlardır. Bu çalışmada, kodon optimize edilmiş Geobacillus stearothermophilus lipaz enzimini kodlayan genin, Pichia pastoris ekspresyon sisteminde güçlü ve indüklenebilir bir promotor olan AOX1 promotoru içeren pPICZA ekspresyon vektörü kullanılarak ekspresyonu yapılmış ve en yüksek lipaz enzimi üretimi gösteren klon belirlenmiştir. Belirlenen klon ile 400 mL indüksiyon besiyerinde 72 saat boyunca üretim gerçekleştirilmiş ve toplanan süpernatant örneğinde enzim aktivitesi, toplam protein ve SDS-PAGE analizi gerçekleştirilmiştir. Rekombinant lipaz enzimi Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminin her aşamasından alınan örneklerde SDS-PAGE analizi yapılmış ve her aşamada elde edilen örneklerde saflaştırma verimi hesaplanmıştır. Saflaştırma işleminden sonra analiz edilen örnekte, en yüksek üretim gösteren klonun 25.02 mg L-1 lipaz üretim seviyesine ulaştığı belirlenmiştir.

  • 
  İncele
• Proje2022/r/ebyu/20400
  Pichia pastoris Aldehit Dehidrogenaz (Ald) Genlerinin Karakterizasyonu ve Asetat Metabolizmasındaki Rollerinin Araştırılması

  Karaoğlan, Mert; Karaoğlan, Fidan Erden

  Metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris rekombinant protein üretimlerinde sıklıkla kullanılan başarılı bir ekspresyon sistemidir. Sunduğu pek çok avantaj sebebiyle tercih edilen bu ekspresyon sistemini geliştirmeye yönelik çalışmalar devam etmekte ve bu sayede hem daha verimli üretim hem de daha geniş ürün yelpazesi için kullanılabilir kılmak hedeflenmektedir. Önceki çalışmalarımız kapsamında ADH3 promotoru ile yapılan rekombinant protein üretimlerinde etanolün fermentasyonun başlangıcında asetata dönüştüğü ve bu asetatın yaklaşık %3 konsantrasyonlara ulaştığında toksik etki yaparak hücre üremesini ve rekombinant protein üretimini tamamen durdurduğu gözlenmiştir. Ayrıca, asetatın çeşitli promotorlar ile yapılan rekombinant protein üretimleri üzerine olan olumsuz etkisinin araştırıldığı çalışmalar bulunmaktadır. P. pastoris asetat metabolizması henüz aydınlatılmamış bir mekanizmadır ve ilk kez bu çalışma kapsamında araştırılmıştır. Bu çalışma kapsamında P. pastoris asetat metabolizmasında rol oynayan genler araştırılmış ve fonksiyonel rolleri ortaya konulmuştur. Çalışmanın konusu genler ile yapılan çalışmalarda karbon kaynağına bağlı olarak genlerin farklı fonksiyonlara sahip olduğu belirlenmiştir. İlgili genlerin karakterize edilmesi ile asetat metabolizmanın aydınlatılmış ve P. pastoris ekspresyon sisteminin daha etkin kullanılmasını sağlayacak önemli veriler elde edilmiştir. Elde edilen veriler sonucunda ilgili genlerin mutasyonu veya aşırı ekspresyonu ile daha yüksek rekombinant protein üretimi seviyesine sahip P. pastoris suşları geliştirilmiştir. Bu sayede, ADH3 promotoru ile yapılan rekombinant protein üretimine yönelik alternatif P. pastoris suşları geliştirilmiş, alternatif karbon kaynaklarının belirlenmesi çalışmaları yapılmış ve ilgili genlerin promotorlarının protein üretimindeki kullanım potansiyelleri de test edilmiştir.

  İncele
• ArticleAçık Erişim2021/r/ebyu/20765
  Β-glukanaz Enziminin Pichia pastoris Ekspresyon Sisteminde Hücre Dışı Üretimi ve Saflaştırılması

  Karaoğlan, Mert; Karaoğlan, Fidan Erden

  Bu çalışmada, Rhizomucor miehei -1,3-1,4-glukanaz geni, Pichia pastoris ekspresyon sisteminde AOX1 promotorunun regülasyonu altında ifade edilmiş ve en yüksek üretim seviyesini sağlayan klon belirlenmiştir. Kodon optimize edilmiş gen, pPICZA ekspresyon vektörüne bağlanmış ve kompetent P. pastoris KM71H hücrelerine aktarılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda zeosin içeren plakalardan otuz transformant seçilerek klonlar protein üretimi için test tüplerinde kültüre alınmıştır. Süpernatant örneklerinde glukanaz enzim aktivitesi ölçülmüş ve en yüksek glukanaz aktivitesi gösteren on klon belirlenmiştir. Ayrıca süpernatant örneklerindeki proteinler SDS-PAGE ile analiz edilmiş ve glukanaz enzimi, yaklaşık 34 ve 38 kDa olmak üzere 2 bant halinde gözlenmiştir. En yüksek glukanaz enzim üretimine sahip klon ile 200 mL indüksiyon ortamında (BMMY) 72 saat boyunca protein üretimi gerçekleştirilmiş ve rekombinant glukanaz enzimi Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminden sonra analiz edilen klonun 79,6 mg/L glukanaz üretim seviyesine ulaştığı belirlenmiştir. Saflaştırma işleminin her aşamasından alınan örneklerin SDS-PAGE analizi, süpernatant örneklerinde de gözlenmiş olan iki protein bandının glukanaz enzimini temsil ettiğini göstermiştir.

  İncele
• Proje2019/r/ebyu/22337
  Heterolog Maya Promotorlarının Pichia pastoris ile Rekombinant Protein Üretiminde Değerlendirilmesi ve Karakterizasyonu

  Karaoğlan, Mert; Karaoğlan, Fidan Erden

  Pichia pastoris rekombinant protein üretimlerinde yaygın olarak kullanılan başarılı bir ökaryotik ekspresyon sistemidir. Bu konukçu sistemin metabolizmasının aydınlatılması ve ekspresyon sistemi olarak geliştirilmesi üzerine çalışmalar hızla devam etmektedir. Promotor üzerine yapılan araştırmalar da bu çalışmalar arasındadır. Rekombinant protein üretiminde promotor seçimi önemli bir aşama olup gerek ekspresyon seviyesini gerekse rekombinant proteinin üretim şeklini (yapısal/indüklemeli) doğrudan belirlemektedir. P. pastoris konukçu sistemi ile kullanılan promotorlar sınırlı sayıda olup, en yaygın kullanılan promotorlar AOX1 ve GAP promotorlarıdır. Bu çalışmanın amacı farklı maya kaynaklarından elde edilecek olan yapısal ve indüklenebilir promotorların P. pastoris ekspresyon sisteminde karakterize edilerek kullanılabilirliğinin araştırılmasıdır. Çalışma kapsamında Kluyveromyces marxianus TPI (Triose Phosphate Isomerase), Hansenula polymorpha PMA (Plasma Membrane ATPase), Candida tropicalis ICL ve Saccharomyces cerevisiae CUP promotoru) test edilmiştir. Çalışmada her bir promotorun fonksiyonel olarak en iyi aktivite gösterdiği karbon kaynağı belirlenmiştir. Ardından belirlenen koşullarda promotor bölgeleri 1500, 1000 ve 500 bç DNA bölgeleri olarak analiz edilmiş ve en iyi aktivite gösteren bölge ile devam edilmiştir. Promotor aktiviteleri raportör gen olarak Aspergillus niger ksilanaz geni (XylB) kullanılarak belirlenmiş ve P. pastoris ile en yaygın kullanılan yapısal GAP promotoru ve indüklenebilir AOX1 promotoru ile karşılaştırılmıştır. Çalışmanın sonunda P. pastoris ekspresyon sisteminde C. tropicalis ICL ve S. cerevisiae CUP promotorlarının indüklenebilir, K. marxianus TPI (Triose Phosphate Isomerase), H. polymorpha PMA promotorlarının yapısal olarak çalıştığı ortaya konmuştur. Promotorların en iyi aktivite gösterdiği karbon kaynakları PMA ve TPI için gliserol, CUP için Glukoz ve ICL için etanol olarak belirlenmiştir. Promotor silme analizleri ile en yüksek aktivite gösteren DNA bölgesi tüm promotorlar için 1000 bç olarak tespit edilmiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar, P. pastoris ekspresyon sisteminin hem araştırma laboratuvarlarında hem de endüstriyel protein üretimlerinde daha etkin kullanılabilmesini sağlayacaktır.

  İncele