Heterolog Maya Promotorlarının Pichia pastoris ile Rekombinant Protein Üretiminde Değerlendirilmesi ve Karakterizasyonu

Pichia pastoris rekombinant protein üretimlerinde yaygın olarak kullanılan başarılı bir ökaryotik ekspresyon sistemidir. Bu konukçu sistemin metabolizmasının aydınlatılması ve ekspresyon sistemi olarak geliştirilmesi üzerine çalışmalar hızla devam etmektedir. Promotor üzerine yapılan araştırmalar da bu çalışmalar arasındadır. Rekombinant protein üretiminde promotor seçimi önemli bir aşama olup gerek ekspresyon seviyesini gerekse rekombinant proteinin üretim şeklini (yapısal/indüklemeli) doğrudan belirlemektedir. P. pastoris konukçu sistemi ile kullanılan promotorlar sınırlı sayıda olup, en yaygın kullanılan promotorlar AOX1 ve GAP promotorlarıdır. Bu çalışmanın amacı farklı maya kaynaklarından elde edilecek olan yapısal ve indüklenebilir promotorların P. pastoris ekspresyon sisteminde karakterize edilerek kullanılabilirliğinin araştırılmasıdır. Çalışma kapsamında Kluyveromyces marxianus TPI (Triose Phosphate Isomerase), Hansenula polymorpha PMA (Plasma Membrane ATPase), Candida tropicalis ICL ve Saccharomyces cerevisiae CUP promotoru) test edilmiştir. Çalışmada her bir promotorun fonksiyonel olarak en iyi aktivite gösterdiği karbon kaynağı belirlenmiştir. Ardından belirlenen koşullarda promotor bölgeleri 1500, 1000 ve 500 bç DNA bölgeleri olarak analiz edilmiş ve en iyi aktivite gösteren bölge ile devam edilmiştir. Promotor aktiviteleri raportör gen olarak Aspergillus niger ksilanaz geni (XylB) kullanılarak belirlenmiş ve P. pastoris ile en yaygın kullanılan yapısal GAP promotoru ve indüklenebilir AOX1 promotoru ile karşılaştırılmıştır. Çalışmanın sonunda P. pastoris ekspresyon sisteminde C. tropicalis ICL ve S. cerevisiae CUP promotorlarının indüklenebilir, K. marxianus TPI (Triose Phosphate Isomerase), H. polymorpha PMA promotorlarının yapısal olarak çalıştığı ortaya konmuştur. Promotorların en iyi aktivite gösterdiği karbon kaynakları PMA ve TPI için gliserol, CUP için Glukoz ve ICL için etanol olarak belirlenmiştir. Promotor silme analizleri ile en yüksek aktivite gösteren DNA bölgesi tüm promotorlar için 1000 bç olarak tespit edilmiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar, P. pastoris ekspresyon sisteminin hem araştırma laboratuvarlarında hem de endüstriyel protein üretimlerinde daha etkin kullanılabilmesini sağlayacaktır.